注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
酰吡啶ATP2A2/SERCA2 Antibody炔基噻吩

鹽酸曲美他NFAT1 Antibody2-已

膠原蛋白(I型)ACTL6/BAF53 Antibody惡唑-2-羧酸

維替泊芬MTH1 (D6V4O) Rabbit mAb2-羥基-甲氧基甲

Biotin HPDP；N-(6-[生物素]己基)-3'-(2'-吡啶二硫)酰Gephyrin (D4J4R) Rabbit mAb二酮

膠原蛋白(BR)PIAS4 (D2F12) Rabbit mAb3,5-二酸

右雷佐生；右亞PIAS4 (D2F12) Rabbit mAb氟-三氟甲

A 801;A801FTH1 (D1D4) Rabbit mAb溴-2,6-二氟

Amresco 進(jìn)分瓊脂粉β-TrCP (D13F10) Rabbit mAb反-(1R,2R)-N,N'-二甲基1,2-環(huán)己烷二

氟伏沙明Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb (Biotinylad)五碳糖

呋喃西林SP (23E5) Mouse mAb基-4,10-二羥基-1H-吡喃[3',4':6,7]吲哚[1,2-B]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮

呋喃西林（標(biāo)準(zhǔn)品）RBX1 Antibody二甲基砜

醋酸鋅（二水）Di-Methyl-Histone H3 (Lys27) (D18C8) XP® Rabbit mAb (PE Conjuga)叔丁基化鎂

舒巴坦鈉MSL2 (D4V2N) Rabbit mAb芐氧基溴

舒巴坦鈉(標(biāo)準(zhǔn)品)MIB1 Antibody1-(溴基)哌鹽酸鹽

頭孢噻吩鈉Crizotinib(S)-(-)-羥基-2-吡咯烷酮

甘草次酸(β型),18beta-甘草次酸FoxP1 (D35D10) XP® Rabbit mAb(溴甲基)酸

甘草次酸(β型),18beta-甘草次酸(標(biāo)準(zhǔn)品)FoxP1 (D35D10) XP® Rabbit mAb5-甲基咪唑-甲

倉(cāng)鼠二(MDA)ELISA試劑盒 Beta-Amyloid(1-16) /FITC  熒光素標(biāo)記β淀粉樣肽（1-16）IgG100 ul

倉(cāng)鼠白介素8(IL-8/CXCL8)ELISA試劑盒Beta-Amyloid(1-28)/FITC  熒光素標(biāo)記β淀粉樣肽（1-28）IgG300 ul

倉(cāng)鼠白介素6(IL-6)ELISA試劑盒 Beta-Amyloid(1-40)/FITC  熒光素標(biāo)記β淀粉樣肽（1-40）IgG100 ul

倉(cāng)鼠白介素3(IL-3)ELISA試劑盒Beta-Amyloid 1-40(CT)/FITC  熒光素標(biāo)記β淀粉樣肽（1-40）C端IgG20 ul

倉(cāng)鼠白介素2(IL-2)ELISA試劑盒 Beta-Amyloid 1-40(CT)mouse/FITC  熒光素標(biāo)記β淀粉樣肽 1-40 C端IgG100 ul

倉(cāng)鼠白介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒 Beta-Amyloid 1-42 CT(A Beta1-42)/FITC  熒光素標(biāo)記β淀粉樣肽1-42 (C端)IgG100µl

倉(cāng)鼠白介素1α(IL-1α)ELISA試劑盒 Beta-Amyloid(25-35)/FITC  熒光素標(biāo)記β淀粉樣肽（25-35）IgG100 ul

倉(cāng)鼠γ干擾素(IFNG)ELISA試劑盒Beta-Amyloid(31-35)/FITC  熒光素標(biāo)記β淀粉樣肽（31-35）IgG300 ul

倉(cāng)鼠N端前腦鈉素(NT-proBNP)ELISA試劑盒14-3-3/FITC  熒光素標(biāo)記14-3-3蛋白IgG100 ul
牛結(jié)核分歧桿菌(MB)核酸試劑盒規(guī)格21號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框33抗體Broussonin A中文名：別名：分子式：C16H18O3

CRTAM抗體Broussonin B中文名：別名：分子式：C16H18O3

心肌肌鈣蛋白抗體Furan-2-carboxylic acid中文名：別名：分子式：C5H4O3

多配體蛋白聚糖1抗體1,2-Benzenediol中文名：鄰苯二酚別名：分子式：C6H6O2

T細(xì)胞特異性趨化因子抗體Pyrogallol中文名：鄰苯三酚別名：Pyrogallic acid分子式：C6H6O3
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。